La lisi cellulare seguita dal rilascio di DNA genomico è un dilemma in corso nelle tecniche di biologia molecolare.

Nella maggior parte dei casi, tecnologie come la PCR e altre tecniche di amplificazione richiedono fasi di estrazione e purificazione del DNA. Smart Amplification versione 2 (SmartAmp2) è una tecnologia di amplificazione isotermica e integrata che elimina la necessità di una lunga preparazione del campione per il rilevamento rapido degli acidi nucleici, inclusi i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), le mutazioni e altri bersagli. Inoltre, l’amplificazione del DNA direttamente dal sangue intero è benefica e riduce il rischio di contaminazione incrociata. I test SmartAmp2 tradizionali consistono in due fasi e richiedono un pretrattamento alcalino a 98 gradi C prima di una corsa a 60 gradi.

Per rendere SmartAmp2 veramente isotermico e semplificare l’amplificazione del DNA, introduciamo SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), un tampone di lisi caotropico di nuova concezione che consente il recupero  e la denaturazione simultanei del materiale genomico direttamente dal sangue intero a una temperatura uniforme di 60 gradi C. Isolamento migliorato Il metodo Whole Blood Nucleic Acids è una pietra miliare nella creazione di uno SmartAmp2 veramente isotermico dall’inizio alla fine a una singola temperatura, aumentandone il potenziale per l’uso di routine nei test al letto del paziente. Inoltre, il pretrattamento con SIL-B consente l’amplificazione PCR del materiale genomico direttamente dal sangue intero.

 

 

Amplificazione diretta di SARS-CoV-2 mediante RT-PCR da campioni clinici utilizzando un tampone concentrato di lisi-amplificazione del virus preparato con IGEPAL-630

La pandemia del 2019 causata dal nuovo coronavirus (SARS-CoV-2) continua a diffondersi rapidamente in tutto il mondo. L’amplificazione dell’acido nucleico funge da gold standard per la conferma dell’infezione da COVID-19. Tuttavia,  le sfide affrontate dai laboratori diagnostici nei paesi sottosviluppati includono la mancanza di kit e materiali per la purificazione dell’RNA virale. Pertanto, è necessario verificare urgentemente metodi alternativi per isolare gli acidi nucleici per SARS-CoV-2.

I nostri risultati mostrano che un tampone di amplificazione della lisi virale concentrato (vLAB) preparato con detergente non ionico IGEPAL consente il rilevamento qualitativo di SARS-CoV-2 mediante reazione a catena diretta della trascrittasi-polimerasi inversa (dRT-PCR). Inoltre, vLAB ha effettivamente inattivato SARS-CoV-2. Poiché questo metodo è poco costoso e non sono necessarie apparecchiature di purificazione dell’RNA o sintesi aggiuntiva di cDNA, la dRT-PCR di vLAB dovrebbe essere considerata un metodo alternativo per il rilevamento qualitativo di SARS-CoV-2.

Lo scopo di questo studio era il rilevamento diretto del coronavirus felino mediante PCR in tempo reale e tre diversi test di immunocromatografia rapida (RIM) per rilevare gli antigeni nei campioni felini dei rifugi.

L’utilità dei test RIM è stata confrontata in base alla sensibilità e specificità calcolate per ciascuno dei test RIM. Sono stati testati settanta campioni fecali di gatti di rifugio in quarantena. Dei 70 campioni analizzati mediante PCR in tempo reale, 44 (62,9%) erano positivi. Significativamente più gatti (  p   <0,05) sono risultati positivi che negativi. Né l’età né il sesso dei gatti hanno giocato un ruolo significativo (  p   > 0,05) nell’escrezione virale.

La sensibilità dei test RIM è risultata bassa (<35%; test RIM A e C) a un livello soddisfacente (> 50%, test RIM B). Il numero di particelle virali determinato dall’analisi RT-PCR in tempo reale non era significativamente correlato ai risultati rilevati in nessuno dei saggi RIM (  p   > 0,05). I risultati di questo studio indicano che l’uso dei test antigenici rapidi RIM nello screening di routine per lo stato di eliminazione di FCoV nei  gatti da rifugio è limitato a causa dell’elevato numero di risultati falsi negativi.

Il COVID-19 è una malattia infettiva che ha causato una pandemia globale che colpisce persone in tutto il mondo. Poiché il rilevamento delle malattie e l’introduzione dei vaccini continuano, sono ancora necessari strumenti diagnostici efficaci per soddisfare le esigenze di test continui. Questo studio preliminare ha valutato un nuovo test diagnostico SARS-CoV-2 chiamato DirectDetect SARS-CoV-2 Real Time Direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) basato su una dimensione del campione limitata di 24 campioni di respiro con 14 SARS-CoV – 2 -pazienti positivi. Il test è superiore ad altri test disponibili in commercio in quanto non richiede il mezzo di trasporto del virus o l’estrazione dell’RNA virale prima dell’amplificazione e del rilevamento dell’acido nucleico.

Questa capacità trasforma ore di tempo di preparazione del campione in una procedura che richiede minuti, eliminando la necessità di molti reagenti costosi che possono essere difficili da ottenere durante il picco nel test dell’acido nucleico durante una pandemia. I risultati mostrano una concordanza positiva del 94,7, 100 e 94,7% tra tamponi asciutti con campioni, campioni trattati e non trattati testati con DirectDetect SARS-CoV-2 RT-PCR diretta in tempo reale rispetto ai test utilizzati in laboratorio clinico, rispettivamente.

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-010 GenDepot 100ml 208.8 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-050 GenDepot 500ml 380.4 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 202.8 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 424.8 EUR

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, UNASSEMBLED

SCT-50ML-500 CORNING 50/pk 104.4 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml

Q2AB1-50ml EnQuireBio 50ml 483.6 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml

Q2AB2-50ml EnQuireBio 50ml 483.6 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile

4870 Scientific Laboratory Supplies PK200 279.3 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 1/Bag Sterile

4871 Scientific Laboratory Supplies PK100 323.76 EUR

Simax Reagent Bottle Narrow Mouth Amber 50ml

BOT64222 Scientific Laboratory Supplies PK10 52.1 EUR

Select Reagent Bottle Wide Mouth Clear 50ml

BOT64420 Scientific Laboratory Supplies PK10 52.1 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

AxyPrep Mag PCR Normaliser- 50mL

AXY1054 Scientific Laboratory Supplies EACH 1633.62 EUR

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions

4615 Intact Genomics 1/EA 621.6 EUR

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-50P Yeastern Biotech 50 Preps Ask for price

AxyPrep Mag PCR clean up -50mL

AXY1046 Scientific Laboratory Supplies EACH 1511.64 EUR

Reagent Bottle Clear Narrow neck with plastic stopper 50ml

BOT2140 Scientific Laboratory Supplies PK10 38.19 EUR

Reagent Bottle Amber Narrow neck with plastic stopper 50ml

BOT2156 Scientific Laboratory Supplies PK10 44.57 EUR

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED

SCT-50ML-25-S CORNING 25/pk 117.6 EUR

PCR Tubes (50)

PCR-50 BioAssay Systems 50 15 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-50P Yeastern Biotech 50 Preps; Ask for price

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, RACKED, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED

SCT-50ML-R-S CORNING 250/pk 127.2 EUR

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer120ml Abbexa Lysis Buffer 1 (20 ml) 184.8 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer3100ml Abbexa Lysis Buffer 3 (100ml) 276 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer420ml Abbexa Lysis Buffer 4 (20 ml) 184.8 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-48D Bioingentech 50T 510.96 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-96D Bioingentech 100T 625.8 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-48D Bioingentech 50T 510.96 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-96D Bioingentech 100T 625.8 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-96R Bioingentech 100T 1030.8 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-48D Bioingentech 48T 543.6 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-96D Bioingentech 96T 686.4 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-48D Bioingentech 48T 543.6 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-96D Bioingentech 96T 686.4 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-48R Bioingentech 50T 813.6 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 658.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 5026.8 EUR

Combitips Adv. PCR Clean 50ml 4 packs of 25

E0030089847 Scientific Laboratory Supplies PK100 156.18 EUR

EP Reagent Biuret Reagent

1011601 Scientific Laboratory Supplies 1L 42.18 EUR

EP Reagent Iodoplatinate Reagent

1046300 Scientific Laboratory Supplies 200ML 360.24 EUR

EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent

1053601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 354.54 EUR

EP Reagent Molybdovanadic Reagent

1056700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 42.18 EUR

EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent

1065000 Scientific Laboratory Supplies 100ML 161.88 EUR

Direct Black 38

HY-D0256 MedChemExpress 100mg 129.6 EUR

Direct Tube Marker

PCR1414 Scientific Laboratory Supplies EACH 6344.1 EUR

Trichomonas Fetus PCR kit

PCR-V213-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Trichomonas Fetus PCR kit

PCR-V213-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Clostridium septicum PCR kit

PCR-V214-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Clostridium septicum PCR kit

PCR-V214-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Clostridium sordellii PCR kit

PCR-V215-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Clostridium sordellii PCR kit

PCR-V215-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Trypanosoma brucei PCR kit

PCR-V217-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Trypanosoma brucei PCR kit

PCR-V217-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Corynebacterium bovis PCR kit

PCR-V219-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Corynebacterium bovis PCR kit

PCR-V219-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Bovine coronavirus PCR kit

PCR-V220-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Bovine coronavirus PCR kit

PCR-V220-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Bluetongue disease PCR kit

PCR-V224-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

Bluetongue disease PCR kit

PCR-V224-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Aeromonas hydrophila PCR kit

PCR-V240-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Aeromonas hydrophila PCR kit

PCR-V240-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Flavobacterium columnare PCR kit

PCR-V242-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V242-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Kudoa sp. PCR kit

PCR-V243-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V243-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Nucleospora salmonis PCR kit

PCR-V244-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V244-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Piscirickettsia salmonis PCR kit

PCR-V245-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Renibacterium salmoninarum PCR kit

PCR-V246-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Streptococcus phocae PCR kit

PCR-V247-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Vibrio sp. PCR kit

PCR-V248-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Yersinia ruckeri PCR kit

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Streptococcus iniae PCR kit

PCR-V251-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Akabane virus PCR kit

PCR-V267-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

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Piscine reovirus PCR kit

PCR-V268-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

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Hirame rhabdovirus PCR kit

PCR-V269-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

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Marine birnavirus PCR kit

PCR-V270-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

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Monodon baculovirus PCR kit

PCR-V280-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V280-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Vibrio parahaemolyticus PCR kit

PCR-V282-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Vibrio parahaemolyticus PCR kit

PCR-V282-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Baculovirus penaei PCR kit

PCR-V285-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V285-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Enterocytozoon Hepatopenaei PCR kit

PCR-V287-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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Irido virus PCR kit

PCR-V288-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

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PCR-V288-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Mourilyan virus PCR kit

PCR-V291-48R Bioingentech 50T 987.6 EUR

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PCR-V291-96R Bioingentech 100T 1335.6 EUR

Theileria annulata PCR kit

PCR-V299-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Theileria annulata PCR kit

PCR-V299-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Theileria parva PCR kit

PCR-V300-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Theileria parva PCR kit

PCR-V300-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Aegyptianella pullorum PCR kit

PCR-V302-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Aegyptianella pullorum PCR kit

PCR-V302-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

Theileria sp. PCR kit

PCR-V303-48D Bioingentech 50T 543.6 EUR

Theileria sp. PCR kit

PCR-V303-96D Bioingentech 100T 686.4 EUR

I risultati indicano che DirectDetect può essere utilizzato per molti diversi tipi di campioni riducendo il numero di reagenti e il tempo necessario per la diagnosi. Sebbene questo studio mostri risultati promettenti utilizzando i risultati DirectDetect, è necessaria un’ulteriore convalida di questo test con un set più ampio di campioni per valutare le prestazioni effettive di questo test.

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