La lisi cellulare seguita dal rilascio di DNA genomico è un dilemma in corso nelle tecniche di biologia molecolare.

| GianfrancoGianfranco | 0 Comment

Nella maggior parte dei casi, tecnologie come la PCR e altre tecniche di amplificazione richiedono fasi di estrazione e purificazione del DNA. Smart Amplification versione 2 (SmartAmp2) è una tecnologia di amplificazione isotermica e integrata che elimina la necessità di una lunga preparazione del campione per il rilevamento rapido degli acidi nucleici, inclusi i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), le mutazioni e altri bersagli. Inoltre, l’amplificazione del DNA direttamente dal sangue intero è benefica e riduce il rischio di contaminazione incrociata. I test SmartAmp2 tradizionali consistono in due fasi e richiedono un pretrattamento alcalino a 98 gradi C prima di una corsa a 60 gradi.

Per rendere SmartAmp2 veramente isotermico e semplificare l’amplificazione del DNA, introduciamo SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), un tampone di lisi caotropico di nuova concezione che consente il recupero  e la denaturazione simultanei del materiale genomico direttamente dal sangue intero a una temperatura uniforme di 60 gradi C. Isolamento migliorato Il metodo Whole Blood Nucleic Acids è una pietra miliare nella creazione di uno SmartAmp2 veramente isotermico dall’inizio alla fine a una singola temperatura, aumentandone il potenziale per l’uso di routine nei test al letto del paziente. Inoltre, il pretrattamento con SIL-B consente l’amplificazione PCR del materiale genomico direttamente dal sangue intero.

 

 

Amplificazione diretta di SARS-CoV-2 mediante RT-PCR da campioni clinici utilizzando un tampone concentrato di lisi-amplificazione del virus preparato con IGEPAL-630

La pandemia del 2019 causata dal nuovo coronavirus (SARS-CoV-2) continua a diffondersi rapidamente in tutto il mondo. L’amplificazione dell’acido nucleico funge da gold standard per la conferma dell’infezione da COVID-19. Tuttavia,  le sfide affrontate dai laboratori diagnostici nei paesi sottosviluppati includono la mancanza di kit e materiali per la purificazione dell’RNA virale. Pertanto, è necessario verificare urgentemente metodi alternativi per isolare gli acidi nucleici per SARS-CoV-2.

I nostri risultati mostrano che un tampone di amplificazione della lisi virale concentrato (vLAB) preparato con detergente non ionico IGEPAL consente il rilevamento qualitativo di SARS-CoV-2 mediante reazione a catena diretta della trascrittasi-polimerasi inversa (dRT-PCR). Inoltre, vLAB ha effettivamente inattivato SARS-CoV-2. Poiché questo metodo è poco costoso e non sono necessarie apparecchiature di purificazione dell’RNA o sintesi aggiuntiva di cDNA, la dRT-PCR di vLAB dovrebbe essere considerata un metodo alternativo per il rilevamento qualitativo di SARS-CoV-2.

Lo scopo di questo studio era il rilevamento diretto del coronavirus felino mediante PCR in tempo reale e tre diversi test di immunocromatografia rapida (RIM) per rilevare gli antigeni nei campioni felini dei rifugi.

L’utilità dei test RIM è stata confrontata in base alla sensibilità e specificità calcolate per ciascuno dei test RIM. Sono stati testati settanta campioni fecali di gatti di rifugio in quarantena. Dei 70 campioni analizzati mediante PCR in tempo reale, 44 (62,9%) erano positivi. Significativamente più gatti (  p   <0,05) sono risultati positivi che negativi. Né l’età né il sesso dei gatti hanno giocato un ruolo significativo (  p   > 0,05) nell’escrezione virale.

La sensibilità dei test RIM è risultata bassa (<35%; test RIM A e C) a un livello soddisfacente (> 50%, test RIM B). Il numero di particelle virali determinato dall’analisi RT-PCR in tempo reale non era significativamente correlato ai risultati rilevati in nessuno dei saggi RIM (  p   > 0,05). I risultati di questo studio indicano che l’uso dei test antigenici rapidi RIM nello screening di routine per lo stato di eliminazione di FCoV nei  gatti da rifugio è limitato a causa dell’elevato numero di risultati falsi negativi.

Il COVID-19 è una malattia infettiva che ha causato una pandemia globale che colpisce persone in tutto il mondo. Poiché il rilevamento delle malattie e l’introduzione dei vaccini continuano, sono ancora necessari strumenti diagnostici efficaci per soddisfare le esigenze di test continui. Questo studio preliminare ha valutato un nuovo test diagnostico SARS-CoV-2 chiamato DirectDetect SARS-CoV-2 Real Time Direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) basato su una dimensione del campione limitata di 24 campioni di respiro con 14 SARS-CoV – 2 -pazienti positivi. Il test è superiore ad altri test disponibili in commercio in quanto non richiede il mezzo di trasporto del virus o l’estrazione dell’RNA virale prima dell’amplificazione e del rilevamento dell’acido nucleico.

Questa capacità trasforma ore di tempo di preparazione del campione in una procedura che richiede minuti, eliminando la necessità di molti reagenti costosi che possono essere difficili da ottenere durante il picco nel test dell’acido nucleico durante una pandemia. I risultati mostrano una concordanza positiva del 94,7, 100 e 94,7% tra tamponi asciutti con campioni, campioni trattati e non trattati testati con DirectDetect SARS-CoV-2 RT-PCR diretta in tempo reale rispetto ai test utilizzati in laboratorio clinico, rispettivamente.

EP Reagent Biuret Reagent - 100ML
1011601 Scientific Laboratory Supplies 1L 59.4 EUR

Select Reagent Bottle Wide Mouth Clear 50ml - PK10
BOT64420 Scientific Laboratory Supplies PK10 68.85 EUR

Simax Reagent Bottle Narrow Mouth Amber 50ml - PK10
BOT64222 Scientific Laboratory Supplies PK10 68.85 EUR

Tail Lysis Buffer
06169-95 NACALAI TESQUE 500ML 61.6 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-00-10rxns Vazyme 10 rxns 1.09 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 159.5 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-02-200rxns Vazyme 200 rxns 165.16 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile - PK200
4870 Scientific Laboratory Supplies PK200 336.15 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 1/Bag Sterile - PK100
4871 Scientific Laboratory Supplies PK100 390.15 EUR

EP Reagent Iodoplatinate Reagent - 200ML
1046300 Scientific Laboratory Supplies 200ML 502.2 EUR

EP Reagent Molybdovanadic Reagent - 100ML
1056700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 59.4 EUR

Direct PCR Complete Kit
S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit
S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent - 100ML
1053601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 490.05 EUR

EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent - 100ML
1065000 Scientific Laboratory Supplies 100ML 226.8 EUR

Direct Blood PCR Kit
E0950-01 EURx 100reactions 69.76 EUR

Direct Blood PCR Kit
E0950-02 EURx 500reactions 277.95 EUR

Direct Plant PCR Kit
E0960-01 EURx 100reactions 55.59 EUR

Direct Plant PCR Kit
E0960-02 EURx 500reactions 251.79 EUR

Direct Blood PCR Kit
MBPCR171-100R EWC Diagnostics 1 unit 267.52 EUR

Direct Blood PCR Kit
MBPCR171-10R EWC Diagnostics 1 unit 71.73 EUR

Direct Tissue PCR Kit
E0940-01 EURx 100reactions 55.59 EUR

Direct Tissue PCR Kit
E0940-02 EURx 500reactions 251.79 EUR

Blood Direct PCR Kit V2
PD103-01 Vazyme 50 rxn 51.41 EUR

Blood Direct PCR Kit V2
PD103-02 Vazyme 200 rxn 188.5 EUR

Tail Lysis Buffer 1
10450042-1 Bio-WORLD 250 mL 44.22 EUR

Tail Lysis Buffer 1
10450042-2 Bio-WORLD 500 mL 66.89 EUR

Tail Lysis Buffer 2
10450044-1 Bio-WORLD 250 ml 33.33 EUR

Tail Lysis Buffer 2
10450044-2 Bio-WORLD 500 ml 55.65 EUR

Tail Lysis Buffer 3
10450046-1 Bio-WORLD 250 ml 33.33 EUR

Tail Lysis Buffer 3
10450046-2 Bio-WORLD 500 ml 66.89 EUR

Tail Lysis Buffer 4
10450048-1 Bio-WORLD 500 ml 55.77 EUR

EzWay Plant Direct PCR Kit
K0568700 KOMA BIOTECH 1set 188 EUR

Mouse tissue direct PCR kit
EP033 ELK Biotech 50T 125 EUR

Mouse tissue direct PCR kit
EP033-200T ELK Biotech 200T 125 EUR

Mouse tissue direct PCR kit
EP033-50T ELK Biotech 50T 40 EUR

Mouse Tissue Direct PCR Kit
RK20736 Abclonal 100RXN 149.88 EUR

DIRECTPCR LYSIS RGNT (YOLK SAC)
201-Y Viagen 50 ml 95 EUR

DIRECTPCR LYSIS RGNT (YOLK SAC)
202-Y Viagen 100 ml 159 EUR

BCA Reagent, 16ML
C144-16ML Arbor Assays 16ML 132 EUR

TDA Reagent - 10mL
MIC6732 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

PYR Reagent - 10mL
MIC6744 Scientific Laboratory Supplies EACH 31.12 EUR

Reagent Bottle Clear Narrow neck with plastic stopper 50ml - PK10
BOT2140 Scientific Laboratory Supplies PK10 45.23 EUR

Reagent Bottle Amber Narrow neck with plastic stopper 50ml - PK10
BOT2156 Scientific Laboratory Supplies PK10 52.79 EUR

Nessler Reagent - 500ML
NESSR Scientific Laboratory Supplies 500ML 205.2 EUR

FastAmp® Plant Direct PCR Kit
4615 Intact Genomics 1/EA 396 EUR

Tail Lysis Buffer 1 2X
10450043-1 Bio-WORLD 250 ml 66.89 EUR

Tail Lysis Buffer 1 2X
10450043-2 Bio-WORLD 500 ml 109.54 EUR

Tail Lysis Buffer 2 2X
10450045-1 Bio-WORLD 250 ml 33.33 EUR

Tail Lysis Buffer 2 2X
10450045-2 Bio-WORLD 500 ml 100.34 EUR

Tail Lysis Buffer 3 2X
10450047-1 Bio-WORLD 500 ml 109.54 EUR

Tail Lysis Buffer 4 2X
10450049-1 Bio-WORLD 500 ml 100.34 EUR

Thioacetamide Reagent - 100ML
THIOR01 Scientific Laboratory Supplies 100ML 112.05 EUR

Silica 3 Reagent - 100ML
27169 Scientific Laboratory Supplies 100ML 112.05 EUR

Color Reagent A, 15ML
X094-15ML Arbor Assays 15ML 59 EUR

Color Reagent A, 38ML
X094-38ML Arbor Assays 38ML 120 EUR

Color Reagent B, 15ML
X095-15ML Arbor Assays 15ML 59 EUR

Color Reagent B, 38ML
X095-38ML Arbor Assays 38ML 120 EUR

Dissociation Reagent, 25ML
X017-25ML Arbor Assays 25ML 242 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Nitrate Reagent A - 10mL
MIC6720 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Nitrate Reagent B- 10mL
MIC6722 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Indole Kovacs Reagent - 10mL
MIC6734 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

MIDASplus 10mL Single Reagent 100mL
M-MDSR-106 MiTeGen 100 ml ml 183 EUR

Folin-Ciocalteus Reagent - 100ML
FOCIRE01 Scientific Laboratory Supplies 100ML 133.65 EUR

Creatinine Color Reagent, 28ML
C004-28ML Arbor Assays 28ML 254 EUR

Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye)
10185ES50 Yeasen Biotechnology 50T 65 EUR

Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye)
10185ES70 Yeasen Biotechnology 200T 235 EUR

EzWay Direct Taq PCR MasterMix (2x)
K0568010 KOMA BIOTECH 1ml 108 EUR

Bottle Reagent 500ml Pyrex - PK10
B54564 Scientific Laboratory Supplies PK10 140.4 EUR

EzWay Direct Hot Taq PCR MasterMix
K0568210 KOMA BIOTECH 1ml 122 EUR

Hemoglobin Detection Reagent, 20ML
C038-20ML Arbor Assays 20ML 242 EUR

EP Reagent Ferroin - 100ML
1038100 Scientific Laboratory Supplies 100ML 108 EUR

jetPRIME kit - 0.75ml reagent + 60ml buffer
PO101000015 Westburg each 636.56 EUR

OOSA09576-50ML - HISPEC ASSAY DILUENT Accessory Reagent
OOSA09576-50ML Aviva Systems Biology 50ml 189 EUR

jetOPTIMUS Transfection Reagent, 0.75mL
PO101000025 Westburg each 665.99 EUR

Voges-Proskauer I Reagent 10mL
MIC6726 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Voges-Proskauer II Reagent 10mL
MIC6728 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

BioLit Animal Tissue Direct PCR Kit (Research)
91210 Sisco Laboratories 50 Preps 222.28 EUR

EzWay Direct Multiplex PCR MasterMix (2x)
K0567840 KOMA BIOTECH 1ml 161 EUR

Indicator Kovacs Indole Reagent - 100ML
KR01 Scientific Laboratory Supplies 100ML 167.4 EUR

Qiagen FTA Purification Reagent - 500ML
FIL5802 Scientific Laboratory Supplies 500ML 462.67 EUR

DetectX® Creatinine Reagent, 20ML
C004-20ML Arbor Assays 20ML 254 EUR

FastAmp® Plant Direct PCR & Genotyping Solution
4611 Intact Genomics 20mL 156 EUR

EP Reagent Starch Sol. - 100ML
1085103 Scientific Laboratory Supplies 100ML 71.55 EUR

MIDASplus HT-96 Single Reagent 100mL
M-MDSR-107 MiTeGen 100 ml ml 183 EUR

jetPRIME kit - 1.5ml reagent + 2x 60ml buffer
PO101000046 Westburg each 1044.22 EUR

Matrix Reagent Reservoirs 100ml (100)
MA8085 Westburg each 133.53 EUR

Olympus 100ml Reagent Reservoir
28-119 Genesee Scientific 5/Bag, 100 Reservoirs/Unit 45.5 EUR

Olympus 100ml Reagent Reservoir
28-120 Genesee Scientific 50 Reservoirs/Unit 33.3 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

cAMP Biotrak(TM) EIA; (Non-Acetylation Protocol; Lysis Reagents not Included); Cytiva; RPN2251 - EACH
GERPN2251 Scientific Laboratory Supplies EACH 770.85 EUR

EP Reagent Ref Sol. BY6 - 100ML
EPBY106 Scientific Laboratory Supplies 100ML 255.15 EUR

Matrix Reagent Reservoirs 25ml (100)
MA8093-11 Westburg each 133.53 EUR

EP Reagent Ninhydrin Sol. - 100ML
1058303 Scientific Laboratory Supplies 100ML 82.35 EUR

Olympus 25ml Reagent Reservoir
28-121 Genesee Scientific 5/Bag, 100 Reservoirs/Unit 45.16 EUR

Olympus 25ml Reagent Reservoir
28-122 Genesee Scientific 50 Reservoirs/Unit 34.22 EUR

Bottle Reagent Pyrex 100ml. - PK10
B54558 Scientific Laboratory Supplies PK10 101.25 EUR

Simax Reagent Bottle 100ml - PK10
BOT53040 Scientific Laboratory Supplies PK10 32.4 EUR

Simax Reagent Bottle 250ml - PK10
BOT53060 Scientific Laboratory Supplies PK10 37.8 EUR

Simax Reagent Bottle 500ml - EACH
BOT5308 Scientific Laboratory Supplies EACH 4.71 EUR

Simax Reagent Bottle 500ml - PK10
BOT53080 Scientific Laboratory Supplies PK10 44.55 EUR

Reagent Bottle Amber 100ml - PK10
BOT64240 Scientific Laboratory Supplies PK10 110.7 EUR

Reagent Bottle Amber 250ml - PK10
BOT64260 Scientific Laboratory Supplies PK10 93.15 EUR

Reagent Bottle Amber 500ml - PK10
BOT64282 Scientific Laboratory Supplies PK10 141.75 EUR

Saliva Direct PCR Kit唾液直接PCR试剂盒
4405A Unibiotest 100 Tests 500 EUR

Saliva Direct PCR Kit唾液直接PCR试剂盒
4405B Unibiotest 500 Tests 500 EUR

PEROXIDE BLOCKING REAGENT Reagent
GWB-Q00308 GenWay Biotech 50 ml Ask for price

Reagent Bottles Amber 500ml - PK10
BOT53080A Scientific Laboratory Supplies PK10 402.3 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

in vivo-jetPEI, 0.1ml reagent +10ml 10% glucose
PO101000040 Westburg each 572.25 EUR

EP Reagent Anisaldehyde Sol. - 100ML
1007301 Scientific Laboratory Supplies 100ML 59.4 EUR

EP Reagent Formaldehyde Sol. - 100ML
1039101 Scientific Laboratory Supplies 100ML 114.75 EUR

Mousetail Direct PCR Kit鼠尾直接PCR试剂盒
4404A Unibiotest 100 Tests 500 EUR

Mousetail Direct PCR Kit鼠尾直接PCR试剂盒
4404B Unibiotest 500 Tests 500 EUR

EP Reagent Picric Acid Sol. - 100ML
1065801 Scientific Laboratory Supplies 100ML 82.35 EUR

EP Reagent Lead Sol. 0.1% Pb - 100ML
5001700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 167.4 EUR

EP Reagent Diphenylamine Sol. - 100ML
10321011 Scientific Laboratory Supplies 100ML 40.5 EUR

Reagent Reservoir 25ml NS - PK100
F267660 Scientific Laboratory Supplies PK100 179.55 EUR

The BCS Screen HT-96 Single Reagent 100mL
M-MDSR-105 MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

EP Reagent Ninhydrin Sol. R1 - 100ML
1058304 Scientific Laboratory Supplies 100ML 82.35 EUR

EP Reagent Ninhydrin Sol. R2 - 100ML
1058305 Scientific Laboratory Supplies 100ML 151.2 EUR

EP Reagent Naphtolbenzein Sol. - 100ML
1057601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 156.6 EUR

EP Reagent Ruthenium Red Sol. - 100ML
1075201 Scientific Laboratory Supplies 100ML 145.8 EUR

EP Reagent Methyl Orange Sol. - 100ML
1054802 Scientific Laboratory Supplies 100ML 59.4 EUR

Bottle Reagent Amber Wn 250ml - PK10
BOT64660 Scientific Laboratory Supplies PK10 128.25 EUR

EP Reagent Phenolphthalein Sol. - 100ML
1063702 Scientific Laboratory Supplies 100ML 59.4 EUR

EP Reagent Nile Blue A Sol. - 100ML
1058201 Scientific Laboratory Supplies 100ML 95.85 EUR

EP Reagent Buffer Sol. pH 3.5 - 500ML
4000600-500ML Scientific Laboratory Supplies 500ML 54 EUR

in vivo-jetPEI, 0.5ml reagent + 2x 10ml 10%glucose
PO101000030 Westburg each 1971.81 EUR

EP Reagent Nitric Acid Dilute - 100ML
1058402 Scientific Laboratory Supplies 100ML 59.4 EUR

The BCS Screen 10 mL kit Single Reagent 100mL
M-MDSR-104 MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

AVIDIN/BIOTIN BLOCKING REAGENT Reagent
GWB-Q00289 GenWay Biotech 30 ml Ask for price

EP Reagent Phenol Red Sol. R2 - 500ML
1063603 Scientific Laboratory Supplies 500ML 112.05 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B1 - 100ML
EPB101 Scientific Laboratory Supplies 100ML 371.25 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B2 - 100ML
EPB201 Scientific Laboratory Supplies 100ML 137.7 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B3 - 100ML
EPB301 Scientific Laboratory Supplies 100ML 137.7 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B4 - 100ML
EPB401 Scientific Laboratory Supplies 100ML 137.7 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B5 - 100ML
EPB501 Scientific Laboratory Supplies 100ML 137.7 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B6 - 100ML
EPB601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 255.15 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B7 - 100ML
EPB701 Scientific Laboratory Supplies 100ML 255.15 EUR

EP Reagent Colour Ref Sol. B8 - 100ML
EPB801 Scientific Laboratory Supplies 100ML 255.15 EUR

I risultati indicano che DirectDetect può essere utilizzato per molti diversi tipi di campioni riducendo il numero di reagenti e il tempo necessario per la diagnosi. Sebbene questo studio mostri risultati promettenti utilizzando i risultati DirectDetect, è necessaria un’ulteriore convalida di questo test con un set più ampio di campioni per valutare le prestazioni effettive di questo test.

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