La polmonite causata da Staphylococcus aureus è associata a un’elevata mortalità, indipendentemente dalla suscettibilità agli antibiotici.

Entrambi i ceppi MRSA e MSSA producono potenti citotossine: alfa-emolisina (Hla) e fino a cinque leucocidine – LukSF-PV, HlgAB, HlgCB, LukED e LukGH (LukAB) – per evitare i meccanismi di difesa innati dell’ospite. È stato dimostrato che le citotossine neutralizzanti forniscono un beneficio di sopravvivenza nei modelli di coniglio con polmonite da S. aureus. Abbiamo studiato i meccanismi di protezione di ASN100, una combinazione di due anticorpi monoclonali umani (mAb), ASN-1 e ASN-2, che insieme neutralizzano Hla e cinque leucocidine, nei modelli di polmonite di coniglio MRSA e MSSA.

Dopo l’immunizzazione profilattica passiva  , l’ASN100 ha mostrato un aumento dose-dipendente della sopravvivenza ed è stato completamente protettivo contro tutti i ceppi di S. aureus testati a dosi di 5 o 20 mg/kg. La patologia polmonare macroscopica e microscopica, il tasso di gonfiore e la carica batterica sono stati valutati 12 ore dopo l’infezione e ridotti con ASN100. L’analisi farmacocinetica di ASN100 nel liquido di lavaggio broncoalveolare di animali non infetti ha mostrato un’efficace penetrazione del liquido epiteliale epiteliale, raggiungendo livelli di picco tra 24 e 48 ore dopo la somministrazione paragonabili alla concentrazione di mAb misurata nel siero. Questi dati confermano che l’ASN100 mAb neutralizza le potenti citotossine di S. aureus nei polmoni e previene i danni alla barriera mucosa e alle cellule immunitarie innate.

 

Conigli transgenici per geni IgG umani.

Obiettivo Preparare anticorpi secondari universali che possono legarsi a IgG di topo e coniglio e utilizzare gli anticorpi in una varietà di test immunologici. Metodi I  geni di fusione della proteina stafilococcica A (SPA), della proteina G dello streptococco (SPG) e della perossidasi di rafano (HRP) sono stati sintetizzati e clonati nel vettore pcDNATM 3.1  per generare plasmidi di espressione eucariotica. I plasmidi sono stati trasfettati transitoriamente in cellule HEK293F per l’espressione.

La proteina di fusione espressa dal plasmide è stata rilevata mediante SDS-PAGE e Western blotting e la sua immunoattività è stata misurata mediante Western blotting, ELISA e colorazione immunoistochimica. Risultati La digestione con enzimi di restrizione e sequenziamento genico ha mostrato che i plasmidi pPA-HRP, pPG-HRP e pPA/G-HRP sono stati generati con successo. La colorazione blu brillante con Coomassie e Western blot ha mostrato che le proteine ​​di fusione PA-HRP, PG-HRP e PA / G-HRP sono state espresse con successo nelle cellule HEK293F. Western blot, ELISA e colorazione immunoistochimica hanno mostrato che le IgG di topo e coniglio potevano essere riconosciute e legate dai tre tipi di proteine ​​di fusione, di cui la proteina di fusione PA/G-HRP mostrava la più alta affinità.

 

Gli animali transgenici contenenti geni di anticorpi umani sono estremamente attraenti per lo sviluppo di farmaci perché bypassano le successive procedure di umanizzazione degli anticorpi richieste per la traduzione terapeutica.

  • Le piattaforme transgeniche sono state create in precedenza utilizzando topi, ma più recentemente anche ratti, polli e mucche e ora sono ampiamente utilizzate nello sviluppo di farmaci. Tuttavia, la generazione di anticorpi a base di coniglio, con grandi guadagni in termini di specificità e affinità, è in grado di coinvolgere la diversificazione della sequenza attraverso la conversione genica, migliorando così la maturazione del legame e migliorando la varianza/selezione degli anticorpi di partenza in un modo diverso rispetto ai roditori.
  • Poiché inoltre spesso consente una buona generazione di un buon legame contro antigeni che sono solo debolmente immunogenici in altri organismi, è una specie molto interessante per la produzione di anticorpi terapeutici. Qui descriviamo la produzione, l’uso e l’analisi del primo ceppo di coniglio transgenico per la produzione di anticorpi umani.
  • Eliminando i geni IgM endogeni e introducendo sequenze di immunoglobuline umane,  questo ceppo di coniglio è stato progettato per generare un repertorio molto diversificato di anticorpi IgG umani. Inoltre, abbiamo introdotto i geni umani CD79a / b e Bcl2 (linfoma a cellule B 2) che migliorano l’espressione del recettore delle cellule B e la sopravvivenza delle cellule B.
  • Dopo l’immunizzazione contro il fattore angiogenico BMP9 (proteine ​​morfogenetiche ossee 9), siamo stati in grado di isolare una serie di anticorpi neutralizzanti altamente affini e specifici da questi conigli. L’analisi della sequenza di questi leganti ha mostrato che sia l’ipermutazione somatica che la conversione genica sono pienamente funzionali in questo ceppo, senza pregiudicare un grado molto elevato di umanità. Questa nuova potente strategia transgenica consentirà l’ulteriore espansione dell’uso dei meccanismi immunitari endogeni nello sviluppo di farmaci.

Gli autori descrivono la preparazione di nanofiori in oro platino (AuPt NFs) e mostrano che possono essere utilizzati contemporaneamente come marcatore e come imitatore nei saggi immunologici a flusso laterale (LFI).

AuPt NF sono stati preparati coltivando nanofili di Pt sulla superficie delle nanoparticelle d’oro. Il test prevede la cattura delle proteine ​​bersaglio (qui: IgG di coniglio come analita modello) da un anticorpo di cattura immobilizzato e l’utilizzo di un anticorpo secondario marcato con AuPt NF. In questo modo, AuPt NF vengono catturati dalla zona del test e producono una caratteristica striscia nera per il rilevamento dell’antigene visivo (IgG). Il colore della linea del test può essere ulteriormente migliorato aggiungendo un substrato cromogenico3-ammino-9-etilcarbazolo che viene ossidato cataliticamente dai nanofili di Pt catturati su AuPt NF e produce un colore rosso. I risultati quantitativi sono stati ottenuti leggendo le intensità della linea del test con un lettore di strisce portatile. LFI ha un limite di rilevamento di 5 µg mL-1 per IgG in condizioni sperimentali ottimizzate. Questo è 100 volte inferiore a un LFI convenzionale basato su AuNP.

È possibile che questo test abbia una portata ampia in quanto può essere utilizzato per molti altri scopi per i quali sono disponibili anticorpi adatti. Abstract grafico I nanofiori in oro e platino sono usati come etichetta e come enzima mimico in un test immunologico a flusso laterale IgG altamente sensibile. Il limite di rilevamento del  test di flusso laterale di nanofiori di oro e platino è 100 volte inferiore a quello del test di flusso laterale di nanoparticelle d’oro convenzionale.

Der p 5 è ​​uno dei più importanti allergeni degli acari della polvere domestica in Algeria; questo allergene è spesso riconosciuto dai pazienti con asma allergico. Tuttavia, non ci sono informazioni sui suoi epitopi di legame IgG. Nel presente studio, i conigli sono stati immunizzati con l’allergene Der p 5 ricombinante e sono stati raccolti campioni di siero. Il riconoscimento degli epitopi IgG Der p 5 lineari è stato determinato utilizzando peptidi sintetizzati derivati ​​dalla sequenza di allergeni.

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I risultati hanno mostrato che il siero dei conigli immunizzati riconosceva i tre epitopi lineari di Der p5 (  28  EDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIK43  ), (  37IHEQIKKGELALFYLQEQ55  ) e  (  92LMQRKDLDIFEQYNLEMAKKS112  )  Più interessante, abbiamo osservato che la sequenza amminoacidica di  92  LS  112  è ben riconosciuto sia dagli anticorpi IgE che IgG. Der p 5 stimola la sintesi di anticorpi IgG specifici che riconoscono epitopi comuni ma anche nuovi rispetto al legame degli anticorpi IgE. In effetti, il potenziale per indurre anticorpi IgG può essere utilizzato per inibire il legame delle IgE umane agli allergeni, che possono essere parte del meccanismo d’azione dell’immunoterapia specifica

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